一、基本原理 在不用一切標(biāo)準(zhǔn)下立即凍存體細(xì)胞時(shí)，體細(xì)胞內(nèi)和外自然環(huán)境中的水都是產(chǎn)生冰晶，能造成體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生機(jī)械設(shè)備損害、電解質(zhì)溶液上升、血漿滲透壓更改、脫干、PH更改、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)性等，能造成體細(xì)胞身亡。如向細(xì)胞培養(yǎng)液添加保護(hù)膜，可讓冰度減少。

　　在遲緩的凍潔標(biāo)準(zhǔn)下，能使體細(xì)胞內(nèi)水分在凍潔前顯出體細(xì)胞。存儲(chǔ)在-130℃下列的超低溫里能降低冰晶的產(chǎn)生。 體細(xì)胞再生時(shí)速率要快，使之快速根據(jù)體細(xì)胞容易損傷的-5～0℃，體細(xì)胞仍能生長發(fā)育，魅力損傷并不大。 現(xiàn)階段常見的保護(hù)膜為二甲亞砜(DMSO)和凡士林，他們對體細(xì)胞不含毒性，含量小，溶解性大，易透過體細(xì)胞。

　　二、操作流程 (一)凍存

　　1、消化吸收體細(xì)胞(同試驗(yàn)二)，將體細(xì)胞懸浮液搜集至離心管中。

　　2、1000rpm抽濾10分鐘，棄上清液。

　　3、沉定加含維護(hù)液的塑造，記數(shù)，調(diào)節(jié)至5×106/ml上下。

　　4、將懸液分至凍銀行存管中，每管1ml。

　　5、將凍銀行存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火苗密封，密封一定要嚴(yán)，不然再生*易出現(xiàn)崩裂。

　　6、貼標(biāo)簽，注明體細(xì)胞類型，凍存時(shí)間。凍銀行存管外拴一金屬材料吊物和一輕繩。

　　7、按以下次序減溫：室內(nèi)溫度→4℃(20分鐘〕→電冰箱冷藏室(30分鐘)→低溫箱(-30℃1鐘頭)→汽態(tài)氮(30分鐘)→液態(tài)氮。 留意：實(shí)際操作時(shí)要當(dāng)心，以防液態(tài)氮凍傷。液態(tài)氮定期維護(hù)，隨時(shí)隨地填補(bǔ)，絕對不可以蒸發(fā)整潔，一般30立升的液態(tài)氮可用1～1.5月。

　　(二)再生

　　1、提前準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒毀，內(nèi)窗2/3杯37℃的溫開水。

　　2、從液態(tài)氮中取下凍銀行存管、快速放置溫開水中并持續(xù)攪拌。使凍銀行存管中的凍存物在1分鐘以內(nèi)溶化。 3、開啟凍銀行存管，將體細(xì)胞懸浮液吸進(jìn)離心管中。

　　4、1000rpm抽濾10分鐘，棄去上清液。

　　5、沉定加10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打勻稱，再抽濾10分鐘，棄上清液。

　　6、加適度培養(yǎng)液后將體細(xì)胞遷移至塑造瓶中，37℃塑造，第二天觀查生長發(fā)育狀況。

　　三、實(shí)驗(yàn)試劑和器械 器械：液氮罐、凍銀行存管(塑膠螺旋燈專用型凍銀行存管或安瓿瓶)、離心管、塑料吸管、離心脫水機(jī)等 實(shí)驗(yàn)試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)液、含保護(hù)膜的培養(yǎng)液(即凍存液) 附：凍存液配置： 培養(yǎng)液添加凡士林或DSMO，使其終濃度值達(dá)5—20%。保護(hù)膜的類型和使用量視不一樣體細(xì)胞而不一樣。選好后4℃下儲(chǔ)存。